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与进口反相色谱柱息息相关的几大要素

发表时间:2020-03-25      点击次数:1211
   进口反相色谱柱是以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等;常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。其分离原理是依据因溶质疏水性的不同而产生的溶质在流动相与固定相之间分配系数的差异而分离;适用于大多数有机化合物,生物大、小分子,如多肽、蛋白质、核酸、糖缀合物,样品一般应溶于水相体系中。C18柱为常用的反相色谱柱,因为有较高的碳含量和更好的疏水性,所以对于各种类型的样品分子结构有更强的适应能力。
  与反相色谱柱息息相关的几大要素有以下几个:
  1.柱长
  有机小分子和肽类的分辨率随柱长的增加而增加,但是柱长增加并不能使蛋白质和核酸等生物大分子的分辨率显著增加,它们在较短的柱子上往往也有很好的分离效果。
  2.温度
  温度上升,流动相黏度下降,流动速度加快,且流动相与固定相之间的传质速度加快,使分辨率增加。同时,温度上升,分子热运动增加,疏水性作用减弱。升高温度要考虑目标物质的热稳定性。
  3.流动相组成
  流动相的极性越大,溶质的分配系数越大,洗脱时间越短。RPC多采用降低流动相极性(水含量)的线性梯度洗脱法。水是极性z强的溶剂,在反相色谱中常常和基础溶剂配合使用,向流动相中加入不同浓度的、可以与水混溶的有机溶剂,以得到不同强度的流动相,这些有机溶剂称为修饰剂。反相色谱中z常用的有机溶剂有甲醇和乙腈。此外,乙醇、4氢呋喃、异丙醇及二氧六环也常被用作修饰剂。有机溶剂梯度的大小也会影响分辨率,一般梯度越小,分辨率越大。
  4.流动相流速
  有机小分子和肽类的分辨率对流动相流速非常敏感。而蛋白质和核酸等生物大分子的分辨率则不然。流速越小,柱子越长,色谱峰的宽度就越大,分辨率就越小。制备色谱上样过程中的流速对动态吸附容量影响很大。

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