应用 | 生物纳米颗粒的分离纯化

UB系列凭借其充分覆盖生物纳米领域的细孔设计，可以实现生物纳米产品与凝集体等高分子杂质的分离。UB-50适用于50 nm以下目标的分离纯化，UB-100适用于50 nm以上更大尺寸目标的分离纯化。

我们用这两根色谱柱来尝试分离以下一组混合样品（进样量为10 μL）：

1. Dextran 5000 (particle size: 460 nm)  10 mg/mL

2. Hemocyanin (particle size: 37 nm)    0.4mg/mL

3. BSA (Particle size: 6 nm)         1.0 mg/mL

当使用排阻限为50 nm 的UB-50时，右旋糖酐 5000的粒径约460 nm，在UB-50中因为体积大于填料的孔径，因此与填料没有相互作用，在排阻限的位置直接洗脱出来；而粒径为37 nm的血蓝蛋白和粒径为6 nm的牛血清白蛋白在UB-50中得到了比较好的分离，并按照体积从大到小的顺序洗脱。而UB-100的孔径比较大，右旋糖酐5000在色谱柱中与填料发生相互作用而被保留，按照分子量从大到小逐渐洗脱出来，表现出展宽的峰；小分子段的血蓝蛋白和牛血清白蛋白在UB-100中虽有分离效果，但分离度没有在UB-50中的高。实际应用中，可以根据样品的不同尺寸选择合适的型号。

以下是分别使用UB-50和UB-100对生物纳米产品分析纯化的应用实例。

一、诺如病毒样颗粒(VLP)的SEC/MALS分析(UB-50)

我们使用生物纳米产品分析纯化用水溶性SEC(GFC)色谱柱UB-50与各种检测器组合，对来自细胞培养上清的诺如病毒VLP进行了分析。UV(280 nm)检测器用于检测培养过程中产生的全部杂质，MALS散射(LS)检测器对纳米粒子类别的大型目标有灵敏度特别高的响应。此外，通过MALS还可以得到目标物的旋转半径(RMS radius)的估计值。为了更直接地确认VLP的形状、大小等形成情况，我们还使用了透射电子显微镜(TEM)进行了比较。

- 样品信息

Sample: 15 μL Norovirus VLP purification grade

- 分析条件

Column：Shodex UB-50 (8.0 mm I.D. x 300 mm)

Eluent：PBS (-)

Flow rate：0.6 mL/min

Detector：UV (280 nm) (small cell volume), MALS (Multi angle light scattering)

Column temp.：Room temp.

- 分析结果

通过观察TEM，可以很好地确认VLP的形成情况，而且通过MALS得到的结果，大约16分钟处也确认了与TEM相符的粒子大小。尽管这次使用的诺如病毒VLP样品是纯化级别的，但从RMS半径的信息中可以看出存在比正常VLP更大的粒子（如凝集体），并且从UV的分析结果中也暗示了低分子领域仍然残留有生物源性杂质。

UB-50不仅能够对50 nm以下的纳米产品进行分析纯化，以实现目标的分析，而且还兼顾了QC中非常重要的产物与生物源性杂质的分离。此外，UB-50考虑到了实验室规模的制备应用，通过采用26 μm的单分散粒子，实现了在分析生物源成分的高负荷工作流程中仍能保持低压。同时，UB-50具备高耐碱性，可以用碱清洗，从而提高再现性和减少拖尾效应。

二、外泌体的SEC/MALS分析 (UB-100)

我们使用生物纳米产品分析纯化用水溶性尺寸排阻色谱柱UB-100与各种检测器组合，对来自人血浆的外泌体(EV)进行了分析。UV(280 nm)检测器用于检测生物源性杂质整体，荧光(FL; Ex 280 nm / Em 348 nm)检测器主要用于检测蛋白质（以Trp残基为指标），MALS散射(LS)检测器特别对纳米粒子类别的大型目标产生高灵敏度的响应。此外，通过MALS可以得到目标的旋转半径(RMS radius)的估计值。

- 样品信息

Sample: 15 μL Exosome from human plasma purification grade

- 分析条件

Column：Shodex UB-100 (8.0 mm I.D. x 300 mm)

Eluent：PBS (-)

Flow rate：0.6 mL/min

Detector： UV (280 nm) (small cell volume),

      Fluorescence (Ex. 280 nm, Em. 348 nm),  

MALS (Multi angle light scattering)

Column temp.：Room temp.

- 分析结果

根据MALS的信息，大约13分钟附近是以外泌体(EV)为主要组分的区域，并且从RMS半径的信息可以推测分子大小存在分布。本次分析使用的来自人血浆的EV样品虽然是纯化级别的，但从UV、FL的分析结果来看，在EV区域之外也检测到了峰值，可以推测仍含有杂质。

UB-100不仅能够对以外泌体(EV)为主的50 nm以上的纳米产品进行分析纯化，以实现目标的分析，而且还兼顾了QC中非常重要的产物与生物源性杂质的分离。此外，UB-100考虑到了实验室规模的制备应用，通过采用27 μm的单分散粒子，实现了在分析生物源成分的高负荷工作流程中仍能保持低压。同时，UB-100具备高耐碱性，可以用碱清洗，从而提高再现性和减少拖尾效应。

三、UB系列色谱柱的规格

[外壳材质 : SUS]

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