应用 | 抗体药物的分析

1 利妥昔单抗的SEC分析 (LW-803)

使用水溶性SEC(GFC)色谱柱PROTEIN LW-803分析市售的利妥昔单抗(抗CD20单克隆抗体)制剂，确认除mAb以外，也有可能是寡聚体（凝集体）或衍生自mAb的片段(分解产物)的色谱峰。使用两根色谱柱串联分析时，确认存在保留时间和单体非常接近的片段。由于LW-803提升了对于与IgG接近的分子量领域的分离性能，不仅能分离抗体生产过程中产生的高分子凝集体杂质，也能在片段管理上发挥作用。
※凝集体和单体的分离一般使用一根色谱柱即可，如需分离分解产物使用两根色谱柱串联效果更好。
                                               
Sample : 20 µL
Rituximab formulation
(Injection solution)
1. Aggrigates
2. Monomer
3. Citrate

Column: Shodex PROTEIN LW-803 (8.0 mm I.D. x 300 mm)

Eluent: 50 mM Sodium phosphate buffer (pH7.0) + 0.3 M NaCl

Flow rate: 1.0 mL/min

Detector: UV (280 nm)

Column temp.: 25 ℃

2 利妥昔单抗的胰蛋白酶消化分析 (C18U 2D)

肽图分析是生物类药物的确认试验之一。所谓肽图分析，即生物类药物经由酶消化使得肽裂解为小片段，通过反相色谱分离，进行一级构造分析。用于UHPLC的硅胶反相色谱柱C18U系列是使用亚微米有机二氧化硅杂化颗粒作为填料，具有优秀分离度和机械强度的色谱柱。以下应用利用C18U系列色谱柱的高分离性能，使用C18U 2D分析抗体药物的胰蛋白酶消化物，确认了各种消化肽的峰。抗体药物的胰蛋白酶消化物是市售的利妥昔单抗（抗CD20单克隆抗体）制剂通过固定化胰蛋白酶的蛋白质消化试剂盒进行酶消化取得的。
Sample: 5 μL
Tryptic digest of Rituximab formulation
(Injection solution)
0.5 mg/mL

Column: Shodex C18U 2D (2.0 mm I.D. x 150 mm)

Eluent: (A); 0.1 % TFA in H2O (B); 0.1 % TFA in CH3CN

Linear gradient: (B %) 10 to 40 % (0 to 25 min), 40 % (25 to 30 min), 90 % (30 to 35 min)

Flow rate: 0.2 mL/min

Detector: UV (220 nm) (small cell volume)

Column temp.: 40 ℃

3 曲妥珠单抗电荷变异分析 (SP-FT 4A)

由于抗体药物是使用动物细胞生产的，因此由于蛋白质翻译后的修饰，会导致其异质性。为了保持生物药物质量，必须保持异质性的稳定。异质性的变化会影响药物功能，因此必须进行各种质量特性分析。其中之一是电荷变体（电荷异构体）分析。严格控制单克隆抗体的特征非常重要，单克隆抗体因为通常会由于天冬氨酸残基的脱酰胺作用和H链中C端赖氨酸残基的未加工而观察到电荷变异，所以对其配置文件的管理非常重要。以下是使用无孔型填料的强阳离子交换柱IEC SP-FT 4A分析市售曲妥珠单抗制剂的应用实例。流动相使用增加NaCl浓度的梯度条件，和一般弱阳离子交换柱相比，电荷变异体的分离度更高，分析时间更短。

Sample: 5 μL
Trastuzumab formulation 5 mg/mL (in H2O)

Column：

(1) Shodex IEC SP-FT 4A (4.6 mm I.D. x 10 mm; 2.7 μm)

(2) Weak cation exchange column from other manufacturer (4.0mm I.D. x 250mm; 10 μm)

Eluent：

(A); 20 mM *MES buffer (pH7.0),

(B); (A) + 0.5 M NaCl   *MES : 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid
Low pressure linear gradient;
(1) B % = 0 % to 10 % (10 min)  

(2) B % = 0 % to 20 % (20 min)

Flow rate：

(1) 0.5 mL/min  

(2) 1.5 mL/min

Detector：UV (280 nm)

Column temp.：40 ℃

4 多克隆抗体的SEC分离比较（LW-803，KW-803等）

使用水溶性SEC(GFC)用色谱柱PROTEIN LW-803和原先产品（KW-803）以及一般产品分析多克隆抗体（人血清中的IgG）。LW-803使用了适合分析几十万分子量蛋白质的孔径，特别是分子量16万的γ－球蛋白分析效果变好。这部分分离性能提升特别适用于进行抗体医药品IgG的单体、二倍体的分离。

Sample : 5 μL
IgG from human serum 10 mg/mL
1. Aggregates
2. Dimer
3. Monomer

Columns:

Shodex PROTEIN LW-803 (8.0 mm I.D. x 300 mm)

Shodex PROTEIN KW-803 (8.0 mm I.D. x 300 mm)

Eluent: 50 mM Sodium phosphate buffer (pH7.0) + 0.3 M NaCl

Flow rate: 1.0 mL/min

Detector: UV (280 nm)

Column temp.: Room temp.

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